Espettorato indotto e fenotipizzazione dei pazienti con malattie ostruttive delle vie aeree| Rassegna di Patologia dell'Apparato Respiratorio

Abstract

L’espettorato indotto è una metodica scarsamente invasiva utile per valutare l’infiammazione bronchiale. L’induzione tramite nebulizzazione di soluzione salina ipertonica, favorisce l’accumulo e l’espulsione delle secrezioni che raccolte vengono inviate al laboratorio per la processazione. Gli eosinofili sono solitamente scarsamente rappresentati nell’espettorato di soggetti sani, quando la loro percentuale è ≥ 3%, si parla di infiammazione eosinofilica. I neutrofili che possono essere aumentati (≥ 61%) come caratteristica infiammatoria della malattia o a seguito di infezioni, inquinamento atmosferico o fumo di sigaretta, caratterizzano il pattern neutrofilico. Quando sia gli eosinofili che i neutrofili sono elevati il pattern si definisce granulocitico misto. I pazienti asmatici presentano spesso un pattern eosinofilico che può essere parzialmente risolto dalla terapia con corticosteroidi inalatori (ICS). Vi sono soggetti che pur asmatici non presentato infiammazione nelle vie aeree, o per efficacia della terapia, o perché la componente di broncocostrizione e l’ispessimento della parete bronchiale risultano le caratteristiche principali; in questo caso il pattern è paucigranulocitico. Nei pazienti con asma severo, la terapia con ICS non è sufficiente per controllare la malattia. Se il paziente ha un fenotipo infiammatorio T2 [elevati eosinofili nel sangue e/o nell’espettorato, alti livelli di ossido nitrico esalato (FeNO) e/o IgE], può giovarsi di terapie con farmaci biologici. Gli eosinofili nel sangue correlano debolmente con quelli dell’espettorato ma tale correlazione è comunque più elevata rispetto a quella con il FeNO. I pazienti con bronchite cronica ostruttiva (BPCO) hanno solitamente un espettorato mucopurulento caratterizzato da un’elevata percentuale di neutrofili. Un sottogruppo di questi soggetti però può presentare un’infiammazione eosinofilica in alcuni casi più evidente nel sangue che nell’espettorato. In conclusione, la valutazione dell’espettorato indotto può essere utile tutte le volte che è necessario fenotipizzare un paziente dal punto di vista dell’infiammazione bronchiale,

Introduzione

L’espettorato indotto è una metodica non invasiva utile per valutare l’infiammazione delle vie aeree in soggetti che non espettorano spontaneamente. L’espettorato è composto da zone dense di muco che intrappolano cellule derivanti dalle vie aeree principalmente centrali. L’utilità della metodica è soprattutto da ricercare nella possibilità di valutare la quantità (cellularità totale) e la distribuzione delle cellule infiammatorie soprattutto in pazienti con asma ma anche in soggetti con bronchite cronica ostruttiva (BPCO). Da più di 20 anni la metodica è stata standardizzata da linee guida della Società Europea di Pneumologia (ERS) ¹, sia per quanto concerne la fase di induzione che per quella di processazione. Le linee guida GINA per l’asma riportano la metodica dell’espettorato indotto come utile nel fenotipizzare dal punto di vista dell’infiammazione il paziente asmatico soprattutto con asma grave ². La fase di induzione viene in genere effettuata in un ambulatorio di broncostimolazione e il materiale viene poi inviato al laboratorio per la processazione. La metodica tuttavia non ha avuto un’elevata diffusione nei laboratori di routine ed è rimasta limitata a pochi centri specializzati. Mentre le varie fasi della metodica sono rimaste sostanzialmente invariate dalla pubblicazione delle linee guida ERS ¹, sono invece notevolmente aumentate negli anni le informazioni che si sono ottenute da questo campione. Infatti, oltre alla conta delle cellule infiammatorie, diversi mediatori solubili sono stati valutati nel surnatante dell’espettorato processato così come microRNA, esosomi, analisi di metabolomica e proteomica, valutazioni del microbioma e analisi genetiche.

Fase di induzione

Questa fase è necessaria quando il paziente, soprattutto se asmatico, non è in grado di produrre spontaneamente espettorato. Per questo si ricorre alla nebulizzazione di una soluzione salina ipertonica a concentrazione crescente di cloruro di sodio (2, 3, 4, 5%) o alla nebulizzazione di una soluzione salina ipertonica a concertazione costante (4,5%). Le fasi di inalazione della nebbia ipertonica sono solitamente quattro da 5 minuti ciascuna intervallata da misurazioni della funzionalità polmonare ³. La soluzione salina ipertonica favorisce la raccolta dell’espettorato nelle vie aeree e quindi la sua espulsione tramite la tosse, allo stesso tempo però potrebbe indurre una broncocostrizione in soggetti predisposti, quindi per sicurezza il paziente viene trattato prima dell’inizio della procedura con broncodilatatore (solitamente salbutamolo 200 o 400 mg), la funzionalità respiratoria viene quindi valutata e monitorata a termine di ogni periodo di induzione. In caso il soggetto vada incontro a broncocostrizione (caduta del FEV₁ ≥ 20%), l’induzione viene immediatamente interrotta e il paziente trattato ulteriormente con broncodilatatore. Nei pazienti con FEV₁ basale dopo broncodilatatore < 60% del predetto la soluzione salina ipertonica viene sostituita con quella isotonica (0,9%) per evitare il rischio di broncocostrizione. Non sono invece noti dati sulla sicurezza della metodica in pazienti con FEV₁ < 1L o < 50% del predetto ⁴. Dopo ogni periodo di inalazione il paziente viene invitato a tossire e ad espettorare. Il materiale viene raccolto in un contenitore sterile, conservato a 4 °C e inviato al laboratorio entro due ore dalla raccolta. Nonostante la relativa sicurezza della procedura, l’induzione va eseguita da personale tecnico debitamente preparato e in locali idonei con personale di rianimazione a disposizione. La strumentazione viene disinfettata dopo ogni induzione; la presenza di filtri evita la possibilità di contaminazione delle porzioni non monouso dello strumento. Durante la fase di induzione e dopo gli accessi di tosse che aiutano il paziente ad espettorare si genera un aerosol potenzialmente pericoloso soprattutto considerando la possibilità di diffusione di virus. Per questo durante le fasi di picco della recente pandemia causata da SARS-CoV-2, queste manovre sono state prima sospese e poi gradualmente reintrodotte con una serie di precauzioni che prevedono la valutazione del paziente (sintomi ed eventualmente tampone) così come la disinfezione dei locali in cui si esegue l’induzione e la raccolta nell’espettorato. Un consenso sulle condizioni di sicurezza e la selezione dei pazienti durante la diffusione del virus, pubblicato da esperti internazionali, riassume tutte le precauzioni necessarie per eseguire l’induzione, evitando la diffusione di SARS-CoV-2 ⁵.

L’induzione può essere effettuata anche in bambini con più di 6 anni con una relativa sicurezza e probabilità di successo. Gli studi sui bambini provengono soprattutto dall’estero e hanno mostrato che il pre-trattamento anche in questo caso con broncodilatatore riduce notevolmente la possibilità di broncocostrizione con circa il 6% dei bambini sottoposti ad induzione che ha riportato una caduta del FEV₁ del 10% ⁶.

Processazione

Una volta giunto in laboratorio il campione può essere processato in toto o selezionando i “plugs”, le zone più dense di materiale che derivano dalle vie aeree. I metodi sono entrambi accettati dalle linee guida dell’ERS e presentano piccole differenze ⁷. Il primo metodo è più rapido ma ha lo svantaggio che la saliva presente nel campione diluisce il materiale e quando la percentuale di cellule epiteliali squamose, che rappresentano la contaminazione salivare, è > 20%, la riproducibilità della conta delle cellule infiammatorie si riduce. Il metodo di selezione dei “plugs”, pur essendo leggermente più indaginoso e pur richiedendo in alcuni casi l’aiuto del microscopio invertito per individuare l’accumulo di cellule infiammatorie nei piccoli “plugs”, consente di avere un materiale meno contaminato dalla saliva, una conta cellulare più rapida e una concentrazione dei biomarcatori nel surnatante dell’espettorato scarsamente diluita dalla saliva. Una volta selezionato, il materiale viene trattato con ditiotreitolo, un agente riducente che rompendo i ponti disolfuro della mucina, la principale proteina del muco, consente la liberazione delle cellule intrappolate nella trama di muco. Il campione viene quindi centrifugato e risospeso in tampone fosfato con l’aggiunta di proteine (albumina bovina o siero fetale). La cellularità totale viene determinata al microscopio ottico con una camera contaglobuli (Burker o Neubau) in quanto la conta automatizzata delle cellule nel campione di espettorato si è rilevata poco affidabile. La vitalità del campione viene valutata con il colorante Trypan blu che entra solo nelle cellule con membrana danneggiata. Un’elevata cellularità, soprattutto se accompagnata da un’elevata vitalità, è indice di un rapido reclutamento delle cellule infiammatorie nelle vie aeree. La conta differenziale delle cellule viene effettuata allestendo un citospin che può essere colorato con May-Grunwald Giemsa o Diff-Quick. Il blue di toluidina può essere utilizzato per la colorazione di cellule metacromatiche (mastociti e basofili), mentre l’Oil Red per valutare inclusioni citoplasmatiche di natura lipidica presenti soprattutto nei macrofagi e il PERLS per le inclusioni di emosiderina. La conta differenziale al microscopio ottico si effettua contando almeno 400 cellule non squamose, quest’ultime vengono contate a parte come indice della contaminazione salivare del campione.

Valori di normalità e pattern infiammatori

L’espettorato di un soggetto sano è in genere costituito da macrofagi (69,2 ± 13,0%) e neutrofili (27,3 ± 13,0%), mentre eosinofili (0,6 ± 0,8%), linfociti (1,0 ± 1,2%) e cellule epiteliali (1,0 ± 1,2%) sono scarsamente rappresentati ⁸. La riproducibilità del test è buona, almeno per quanto riguarda macrofagi, neutrofili ed eosinofili ⁹. La percentuale di eosinofili e neutrofili del campione è stata utilizzata per definire dei pattern infiammatori specifici. Per quanto riguarda gli eosinofili 3% è considerato il cut-off per definire un incremento significativo rispetto ai soggetti sani. Per i neutrofili invece le percentuali variano notevolmente a seconda degli studi da 40 a 76%. È stato dimostrato in diversi studi che nei soggetti sani l’invecchiamento determina un incremento dei neutrofili nelle vie aeree, non accompagnato dallo stesso incremento nel sangue. Tale incremento potrebbe essere la conseguenza della ridotta capacità immunologica dell’anziano di contrastare infezioni e altri trigger e determinerebbe una sorta di infiammazione minima persistente che potrebbe favorire, in soggetti predisposti, l’instaurarsi di patologie respiratorie ¹⁰. Considerato che l’incremento dell’età si associa anche nei soggetti sani ad un incremento dei neutrofili nelle vie aeree e che diversi fattori tra cui il fumo o lo smog possono aumentare il reclutamento di queste cellule nei bronchi, diversi studi considerano il 61% come cut-off significativo per un’infiammazione neutrofilica. In Tabella I sono indicati i vari pattern infiammatori e relativi cut-off.

Utilità clinica

Asma

I pazienti asmatici presentano molto frequentemente un pattern infiammatorio eosinofilico conseguenza di un endotipo T2 ¹¹. Questi pazienti sono caratterizzati solitamente uno switch dei linfociti T verso il fenotipo Th2 e l’attivazione di linfociti ILC2 coinvolti nell’immunità innata ¹². Un gruppo inferiore di pazienti invece presenta un incremento dei neutrofili nelle vie aeree, in alcuni casi si tratta di pazienti con comorbidità come reflusso gastroesofageo, diabete e/o obesità ^13-15. Infezioni ricorrenti, soprattutto batteriche, inoltre, favoriscono un accumulo nelle vie aeree di neutrofili così come l’esposizione ad inquinanti ambientali o il fumo di sigaretta ^16,17. Mentre nel pattern eosinofilico, il paziente asmatico presenta frequentemente un incremento anche degli eosinofili nel sangue e in alcuni casi un aumento del FeNO, nei pazienti con pattern neutrofilico, la valutazione dell’espettorato rappresenta un’opportunità unica di caratterizzare l’infiammazione locale che frequentemente non si accompagna a variazioni dei neutrofili nel sangue. La valutazione dell’infiammazione tramite espettorato indotto, essendo effettuata in pochi centri specializzati, viene riservata a pazienti con asma grave e utilizzata allo scopo di definire il pattern infiammatorio del paziente prima dell’inizio della terapia con biologici. In alcuni casi, l’espettorato indotto può essere utile anche in pazienti con asma moderato soprattutto in caso di scarsa risposta alla terapia. Il paziente in terapia con corticosteroidi inalatori (ICS) in genere presenta una progressiva diminuzione della componente eosinofilica nell’espettorato essendo queste cellule responsive al trattamento con ICS. La permanenza o in alcuni casi l’aumento degli eosinofili dopo l'inizio della terapia può far sospettare una scarsa aderenza del paziente alla terapia stessa, soprattutto se gli eosinofili nell’espettorato presentano un’elevata vitalità, oppure la loro presenza può suggerire un dosaggio dell’ICS insufficiente per il controllo dell’infiammazione. In pazienti con asma severo, la rinosinusite cronica con poliposi nasale è l’unica comorbidità che in analisi multivariata è associata all’eosinofilia nelle vie aeree (OR = 16,2) ¹⁸. In pazienti con asma severo refrattario seguiti per tre anni, gli eosinofili ripetuti in media 10 volte per paziente, sono rimasti elevati nell’espettorato della quasi totalità dei pazienti ¹⁹. Pazienti con variazioni significative della percentuale di eosinofili durante il follow-up, hanno mostrato una riduzione dei flussi espiratori con una più elevata ostruzione e reversibilità e soprattutto un elevato numero di riacutizzazioni nonostante la terapia inalatoria ICS/LABA rispetto ai pazienti con percentuali di eosinofili persistentemente alti, ad indicare che un aumento significativo degli eosinofili nell’espettorato potrebbe essere un trigger per la riacutizzazione dell’asma ^20,21. Il trattamento con steroidi per via orale è in grado in pazienti con asma severo refrattario di ridurre l’infiammazione eosinofilica nelle vie aeree, sia in termini di eosinofili che di IL-5 nell’espettorato, allo stesso tempo il trattamento può determinare anche una riduzione di IL-8, solitamente associata ad infiammazione neutrofilica ²².

I pazienti con asma severo che vengono indirizzati alla terapia con farmaci biologici, anti IL-5, anti IL5R, anti IgE, anti IL-4R o anti TSLP, nella gran parte dei casi presentano una rapida riduzione degli eosinofili nel sangue mentre la riduzione degli eosinofili nell’espettorato si realizza più lentamente e in alcuni casi non efficacemente ²³. Pazienti non responder alla terapia con anti IL-5, possono presentare una eosinofilopoiesi direttamente a livello bronchiale che alimenta l’infiammazione locale, indipendentemente dagli eosinofili midollari ²³, quindi la valutazione degli eosinofili nell’espettorato in questi pazienti risulta l’unica possibilità per dimostrare l’effettiva efficacia del trattamento terapeutico.

Le fluttuazioni invece dei neutrofili nell’espettorato sembrano essere meno associate alle riacutizzazioni. In pazienti asmatici il pattern granulocitico misto, quello cioè caratterizzato da incremento sia degli eosinofili che dei neutrofili, in studi trasversali, sembra legato ad un incremento dell’età dei pazienti ²⁴, mentre in studi di follow-up a tre anni sembra essere associato ad una maggior caduta del FEV₁ al termine dello studio ²⁰.

Pazienti asmatici con un pattern infiammatorio paucigranulocitico non dovrebbero giovarsi di ulteriori incrementi della terapia con ICS, se stabili, potrebbero essere i pazienti candidati ad uno step down di steroide inalatorio ²⁵. In caso invece di scarso controllo della malattia l’aggiunta di un anticolinergico a lunga durata d’azione (LAMA) potrebbe essere un’opzione da valutare nei soggetti con una scarsa infiammazione nelle vie aeree ².

Un’altra applicazione dell’espettorato indotto nell’asma è la valutazione dei pazienti con asma professionale. L’analisi può essere effettuata prima e dopo un challenge specifico in cabina con la sostanza sospettata di indurre asma professionale. Diversi studi hanno dimostrato come nei pazienti con questo tipo di patologia, la caduta del FEV₁ (≥ 20%) dopo challenge, si accompagna ad un incremento degli eosinofili nell’espettorato indotto 24 ore dopo il challenge. In alcuni casi, pur non verificandosi la caduta del FEV₁, che rappresenta il “gold standard” per la diagnosi di asma professionale, l’incremento degli eosinofili riscontrato dopo il challange può far fare diagnosi di bronchite eosinofila occupazionale ²⁶. In caso di impossibilità ad eseguire il challenge in cabina, la valutazione degli eosinofili nell’espettorato può essere fatto dopo un periodo lavorativo e i risultati confrontati con l’analisi effettuata dopo un periodo di riposo.

BPCO

Il paziente con BPCO produce in genere abbondanti quantità di espettorato e spesso è sufficiente ricorrere alla valutazione dell’espettorato spontaneo invece di indurre l’espettorazione con la nebulizzazione della soluzione salina ipertonica. La qualità del campione spontaneo può essere inferiore soprattutto per quanto riguarda la vitalità cellulare e la presenza di cellule squamose, ma studi di comparazione tra espettorato spontaneo e indotto effettuati negli stessi pazienti hanno mostrato sostanzialmente dati confrontabili per quanto riguarda la percentuale di eosinofili e neutrofili ²⁷. Da alcuni anni ormai è stato dimostrato che una quota, circa il 30%, dei pazienti con BPCO presenta un’infiammazione eosinofilica nelle vie aeree mentre il restante dei pazienti presenta un notevole incremento dei neutrofili e della cellularità totale del campione. A differenza però dei pazienti asmatici, nei pazienti con BPCO la correlazione tra eosinofili nelle vie aeree ed eosinofili nel sangue risulta essere inferiore, con una quota di pazienti che presenta più elevati eosinofili nel sangue rispetto ai bronchi, in alcuni casi correlati alla presenza di ipertensione e comorbidità cardiovascolari ²⁸. Nei pazienti con BPCO, la presenza di eosinofili nell’espettorato è indice di una risposta al trattamento con ICS ²⁹ e pazienti con BPCO di varia gravità valutati retrospettivamente presentavano una minor dispnea, minor compromissione respiratoria e un minor uso di ICS se avevano un profilo infiammatorio nelle vie aeree eosinofilico ³⁰.

Eosinofili nell’espettorato verso altri marcatori di infiammazione T2

Gli eosinofili nell’espettorato indotto sono una valutazione scarsamente invasiva dell’infiammazione bronchiale. Tuttavia, essendo la metodica fattibile solo in centri specializzati, diversi studi hanno cercato di validare biomarcatori che potessero riflettere l’infiammazione eosinofilica bronchiale. Certamente tra questi, gli eosinofili nel sangue sono la misurazione più semplice e meno costosa da effettuare. La valutazione degli eosinofili nel sangue rappresenta una finestra facilmente disponibile per monitorare il passaggio degli eosinofili dal midollo al sito infiammatorio. In aggiunta agli eosinofili nel sangue periferico, la valutazione del FeNO, prodotto dall’ossido nitrico sintetasi inducibile, pur essendo dipendente da IL-13 e non da IL-5 come gli eosinofili nell’espettorato, può indicare uno switch T2 dell’infiammazione bronchiale. Sia gli eosinofili nel sangue che il FeNO correlano, anche se debolmente, con gli eosinofili nell’espettorato in pazienti con asma non controllato ³¹. In pazienti asmatici indipendentemente dal fenotipo, ad esempio con asma severo, non atopico, obesi e fumatori, gli eosinofili nel sangue e il FeNO hanno paragonabile valore predittivo sull’eosinofilia nell’espettorato, più elevato rispetto al valore predittivo delle IgE totali nel sangue ³². Anche la periostina nel sangue, marker T2 così come le IgE totali non hanno mostrato una sufficiente sensibilità e specificità nel predire l’infiammazione nelle vie aeree ³³. In pazienti asmatici fumatori, gli eosinofili nel sangue hanno mostrato il più elevato valore predittivo dell’eosinofilia bronchiale nell’espettorato rispetto a FeNO, periostina sierica, IgE e IL-13 ³⁴. In Tabella II sono riassunti alcuni dei cut-off per gli eosinofili nel sangue e le percentuali di sensibilità e specificità nel predire la presenza di eosinofili nell’espettorato (≥ 2,5 o 3%).

Limiti e nuove valutazioni nell’espettorato

Ad oggi la cellularità dell’espettorato è l’unico biomarcatore dell’espettorato con riconosciuta validità clinica. Numerosi studi sono stati effettuati negli anni per poter individuare ulteriori biomarcatori in questo campione biologico. Molte citochine e molecole proinfiammatorie sono state dosate nel surnatante dell’espettorato. Oltre ai costi di queste valutazioni, bisogna considerare e valutare sempre il possibile effetto del DTT usato nella processazione che può danneggiare anche i biomarcatori che si vogliono studiare o gli anticorpi utilizzati negli immunoassays per dosarli. Nei casi in cui l’effetto dannoso sia dimostrato, l’espettorato dovrebbe essere processato con tampone fosfato senza DTT. Anche la temperatura di processazione deve essere valutata per ridurre l’attivazione di proteasi presenti nelle cellule dell’espettorato, soprattutto nei neutrofili, che possono danneggiare i biomarcatori solubili. L’aggiunta di un cocktail di inibitori di proteasi al campione può essere utile nel mantenere l’integrità delle molecole che si vogliono valutare ³⁵. Recentemente è stato pubblicato uno studio in cui il DTT è stato sostituito con perossido d’idrogeno che funziona da substrato per la catalasi presente nei neutrofili dell’espettorato. Da questa reazione si sviluppa molto velocemente ossigeno sotto forma di bolle che facilitano la dispersione dei “plug” nel campione. Nell’espettorato oltre alle cellule possono essere valutati i cristalli di Charcot-Layden (Fig. 1) che derivano dalla cristallizzazione della galectina 10 che fuoriesce dagli eosinofili. Alcuni studi mostrano che la presenza di questi cristalli in alcuni campioni di espettorato correla con la presenza nel paziente di rinosinusite cronica con poliposi ³⁶. Recentemente ulteriori valutazioni come microRNA ³⁷, extracellular trap ³⁸, esosomi ³⁹, etc., sono state effettuate su campioni di espettorato indotto così come studi di metabolomica che hanno mostrato profili metabolici differenti in pazienti con pattern infiammatori diversi ⁴⁰. L’analisi proteomica dei campioni di espettorato ha mostrato la possibilità di individuare diversi cluster di pazienti all’interno dei classici fenotipi infiammatori ⁴¹. Anche il microbioma presente nell’espettorato di pazienti asmatici si è visto variare a seconda del tipo di infiammazione e della gravità e stabilità della malattia ⁴².

Conclusioni

Numerosi anni sono ormai passati dalla standardizzazione della metodica dell’espettorato indotto. Certamente questo tipo di valutazione non rientra nel percorso diagnostico del paziente asmatico come indagine utile per la diagnosi. La valutazione dell’infiammazione bronchiale tramite espettorato indotto può però essere utile per definire il pattern infiammatorio del paziente, soprattutto se con asma non controllato o con asma severo. Inoltre, le numerose applicazioni della metodica con nuove valutazioni in termini di biomarcatori, esosomi, vescicole con frammenti di RNA, metabolomica etc., forniranno nel futuro ulteriori caratterizzazioni dei pazienti asmatici o con BPCO utili anche a scopo terapeutico.

Figure e tabelle

Figura 1.L’immagine mostra quattro citospin di espettorati. Nel pannello A un campione con diversi eosinofili, nel pannello B un cristallo di Charcot-Layden ed alcuni eosinofili, nel pannello C neutrofili ed un eosinofilo e nel pannello D macrofagi con citoplasma schiumoso presenti in alcuni casi in pazienti con reflusso gastro-esofageo.

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